將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達(dá)。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。大腸桿菌用于表達(dá)重組蛋白有以下特點(diǎn):
易于生長(zhǎng)和控制;用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的材料昂貴;有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)??晒┻x擇。但是,在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工,常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。
表達(dá)載體在基因工程中具有十分重要的作用,原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒,典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件:
(1)選擇標(biāo)志的編碼序列;
(2)可控轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子;
(3)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子,核糖體結(jié)合位點(diǎn));
(4)一個(gè)多限制酶切位點(diǎn)接頭;
(5)宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。
原核表達(dá)一般程序如下:
獲得目的基因-準(zhǔn)備表達(dá)載體-將目的基因插入表達(dá)載體中(測(cè)序驗(yàn)證)-轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌-誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)-表達(dá)蛋白的分析-擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測(cè)
一、試劑準(zhǔn)備
1、LB培養(yǎng)基。
2、100mM IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm濾膜抽濾,-20℃保存。
二、操作步驟
(一)獲得目的基因
1、通過(guò)PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過(guò)RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第yi鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體
1、載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
(三)獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。
2、測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
(四)誘導(dǎo)表達(dá)
1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
2、按1∶50比例稀釋過(guò)夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 ≌0.4-1.0(OD600 0.6,大約需3hr)。
3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
4、分別取菌體1ml,離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻,70℃10min。
5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
三、注意事項(xiàng)
1、選擇表達(dá)載體時(shí),要根據(jù)所表達(dá)蛋白的終應(yīng)用考慮。如為方便純化,可選擇融合表達(dá);如為獲得天然蛋白,可選擇非融合表達(dá)。
2、融合表達(dá)時(shí)在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時(shí),對(duì)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過(guò)程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。