?抗污染抗生素

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如何避免細(xì)胞污染？

1 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)確保處于無(wú)菌環(huán)境，并使用恰當(dāng)?shù)臏缇夹g(shù)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中所使用的培養(yǎng)基或添加的培養(yǎng)物均要確保無(wú)菌無(wú)污染。

3 定期使用顯微鏡或檢測(cè)試劑盒監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基，以確保無(wú)微生物污染。

4 使用抗污染抗生素。在原代細(xì)胞培養(yǎng)或克隆過(guò)程中微生物污染是難以發(fā)現(xiàn)的，Invivogen公司為此設(shè)計(jì)了具有預(yù)防功能的防污染試劑。Invivogen公司可提供的抗污染抗生素有Plasmocin™ prophylactic，Normocin™， Primocin™ 及Fungin™。

如何鑒別細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中被哪種微生物污染？

如果細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中存在細(xì)菌和/或真菌污染，可以使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行鑒別。因?yàn)樗鼈兊纳L(zhǎng)速度很快，可以使細(xì)胞培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁或菌斑，一般48小時(shí)后即可用肉眼檢測(cè)。隨后可使用檢測(cè)試劑盒對(duì)這些微生物種類進(jìn)行鑒定。然而，支原體污染不能直接用肉眼觀察，也不能通過(guò)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行鑒別，只能通過(guò)不一樣的分析方法（如支原體檢測(cè)試劑盒）進(jìn)行檢測(cè)。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體污染很容易被忽視。Invivogen提供的PlasmoTest™支原體污染檢測(cè)試劑盒結(jié)果可靠，分析準(zhǔn)確，尤其是可以排除假陽(yáng)性或不確定的結(jié)果。

針對(duì)不同微生物的污染，應(yīng)如何選擇Invivogen的抗污染抗生素？

在凍存細(xì)胞之前的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，可以添加抗污染抗生素嗎？

可以的，在凍存細(xì)胞之前可以添加Plasmocin™ prophylactic（預(yù)防支原體污染試劑）或廣譜抗生素Normocin™。但是，在這之前需使用光學(xué)顯微鏡鑒定細(xì)胞是否被細(xì)菌或真菌污染，或使用PlasmoTest™支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)是否存在支原體污染。

Invivogen是否可以提供一種可以同時(shí)抵抗細(xì)菌、真菌、支原體污染的抗生素嗎？

Normocin™和Primocin™這兩款抗生素是廣譜性的，可同時(shí)抵御細(xì)菌、真菌、支原體的污染。兩者的區(qū)別是Primocin™推薦用于原代細(xì)胞培養(yǎng)中預(yù)防微生物的污染，而Normocin™則推薦用于細(xì)胞系培養(yǎng)。

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可以同時(shí)使用Invivogen的抗污染抗生素及基因篩選抗生素嗎？抗污染抗生素會(huì)影響基因篩選抗生素的作用效果嗎？

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可同時(shí)使用Invivogen的抗污染抗生素及基因篩選抗生素，抗污染抗生素的使用不會(huì)干擾常用的基因篩選抗生素的作用效果，例如G418, Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B和 Zeocin™。

?細(xì)菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)如何鑒別細(xì)菌污染？

由于細(xì)菌比真核細(xì)胞小很多，因此在細(xì)菌污染的早期階段通常被認(rèn)為是細(xì)胞碎片。這個(gè)時(shí)候應(yīng)使用放大倍數(shù)為100×-400×的光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞培養(yǎng)基的狀態(tài)。如果觀察到黑色斑點(diǎn)、桿狀物或螺旋狀物，那培養(yǎng)基應(yīng)該是被細(xì)菌污染了。由于細(xì)菌生長(zhǎng)快速，在污染后的48小時(shí)內(nèi)便可引起培養(yǎng)基的變化，使培養(yǎng)基變渾濁。若培養(yǎng)基中含有酚紅，由于細(xì)菌的新陳代謝使培養(yǎng)基的pH下降，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基的顏色迅速變?yōu)辄S色。因此在細(xì)菌污染48小時(shí)之后，便可用肉眼直接觀察。微生物污染后的細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)該棄去，但如果沒(méi)有其他替代的培養(yǎng)基可用，則可使用Invivogen的Plasmocin™ Treatment, Normocure™或者 Plasmocure™污染物清除試劑。

當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不確定具體是哪種細(xì)菌污染細(xì)胞時(shí)，應(yīng)該選擇哪種抗污染抗生素？

當(dāng)不確定細(xì)胞是被哪種細(xì)菌污染時(shí)，推薦使用對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有效，具有光譜抗性的Normocure™。目前的研究結(jié)果表明，Normocure™可有效預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染，例如葡萄球菌、無(wú)色桿菌。

?真菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)如何鑒別真菌污染？

由于真菌菌絲可用肉眼或光學(xué)顯微鏡觀察，因此真菌污染細(xì)胞培養(yǎng)基之后可直接通過(guò)肉眼或者光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。酵母（30-10 um）是形態(tài)結(jié)構(gòu)最小的真菌，在光學(xué)顯微鏡下便可被觀察到。另外，真菌的生長(zhǎng)繁殖會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中pH值增加，從而使含酚紅的培養(yǎng)基呈粉色。在大量真菌污染物存在的情況下，菌落可能形成霉菌，漂浮在培養(yǎng)基表面。此時(shí)應(yīng)立即丟棄培養(yǎng)基，以防孢子傳播。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中為預(yù)防或清除真菌污染，Fungin™可以與青霉素、鏈霉素（Pen-Strep）同時(shí)使用嗎？

可以的，Fungin™可以與一般的抗生素如青霉素、鏈霉素一起使用。

Fungin™可以在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacConkey Agar）和血平板培養(yǎng)基中使用嗎？ 

可以的，Fungin™可以在其他培養(yǎng)基，如麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacConkey Agar）和血平板培養(yǎng)基中使用。

已經(jīng)使用Fungin™處理了7天，但不確定真菌污染是否已全部被清除，對(duì)于這個(gè)問(wèn)題有什么建議嗎？

Invivogen建議將培養(yǎng)基分成兩份，一份繼續(xù)使用Fungin™繼續(xù)處理3-4天，另外一份中加入無(wú)Fungin™或青霉素-鏈霉素的新鮮培養(yǎng)基，之后取1 mL至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于20-25℃ 3-5天。此方法可以幫您確認(rèn)培養(yǎng)基中的真菌污染物是否已全部被清除。

推薦使用什么濃度的Fungin™處理細(xì)胞？

說(shuō)明書(shū)中推薦使用50 ug/mL的Fungin™處理細(xì)胞，但Invivogen建議同時(shí)做75 ug/mL的平行處理組，以估計(jì)去除真菌污染的最佳使用劑量。處理時(shí)間應(yīng)持續(xù)5-10天。

?支原體污染

如何使用Invivogen的支原體檢測(cè)試劑盒Plasmo TestTM檢測(cè)支原體？

PlasmoTest™支原體檢測(cè)試劑盒是一種基于細(xì)胞的比色分析方法，利用Toll樣受體II可以識(shí)別支原體成分（脂肽）的能力，誘導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB和其他轉(zhuǎn)錄因子的激活。在支原體存在的情況下，HEK-Blue™-2細(xì)胞表面表達(dá)的TLR2會(huì)激活這些轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而誘導(dǎo)分泌sAP（分泌性堿性磷酸酶）報(bào)告蛋白，可在16 - 24小時(shí)內(nèi)被HEK-Blue™檢測(cè)培養(yǎng)基檢測(cè)到。

Invivogen的支原體檢測(cè)試劑盒Plasmo TestTM只能檢測(cè)活的支原體嗎？

PlasmoTest™支原體檢測(cè)試劑盒是通過(guò)檢測(cè)支原體脂蛋白來(lái)判斷是否有支原體存在的，因此其既可以檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的活的支原體，也可以檢測(cè)死的支原體。

另外，Invivogen的PlasmoTest™支原體檢測(cè)試劑盒不僅可以檢測(cè)支原體的脂蛋白，也可以檢測(cè)細(xì)菌的脂蛋白。但是由于細(xì)菌污染可直接通過(guò)觀察細(xì)胞培養(yǎng)基的狀態(tài)進(jìn)行鑒定，因此，當(dāng)PlasmoTest™檢測(cè)試劑盒結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性，且細(xì)胞培養(yǎng)基無(wú)渾濁、顏色無(wú)變化時(shí)，可以斷定培養(yǎng)基受到了支原體污染。

Invivogen的支原體檢測(cè)試劑盒Plasmo TestTM與其他支原體檢測(cè)試劑盒相比，有什么優(yōu)勢(shì)嗎？

PlasmoTestTM是第一個(gè)基于細(xì)胞分析原理檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中支原體污染的試劑盒，操作者只需具有基本的細(xì)胞培養(yǎng)的知識(shí)即可進(jìn)行操作。試劑盒在過(guò)夜孵育之后，一小時(shí)之內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果。以往常用的支原體檢測(cè)方法是PCR，但這種檢測(cè)方法具有明顯的缺陷，例如假陰性結(jié)果且能夠檢測(cè)的支原體種類受引物限制，無(wú)法對(duì)全部支原體進(jìn)行檢測(cè)。最重要的是，Plasmo TestTM檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性時(shí)，即表明細(xì)胞培養(yǎng)基中存在支原體污染物，因此不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用哪種試劑來(lái)預(yù)防支原體污染？使用那種試劑清除已污染的支原體？

● Plasmocin™ prophylactic（支原體預(yù)防試劑）是專門用于預(yù)防支原體污染的，它含有兩種有效的殺菌成分，作用于蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制。

● Plasmocin™ treatment（支原體清除試劑），可在2 - 3周內(nèi)快速有效地消除支原體污染。如果2-3周之后使用Plasmocin™支原體清除試劑之后無(wú)法有效清除支原體污染，或支原體對(duì)Plasmocin™產(chǎn)生了耐藥性，可使用● Plasmocure™。Plasmocin™ treatment和Plasmocure™均是由兩種不同抗生素混合而成，通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮作用，可使支原體在2 - 3周內(nèi)全部清除。

在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可以直接使用Plasmocure™代替Plasmocin™ treatment清除已污染的支原體嗎？

Plasmocin™ treatment和 Plasmocure™均是混合抗生素，用于清除已污染支原體。然而，Invivogen推薦只有在支原體對(duì)Plasmocin™ treatment產(chǎn)生抗性的情況下才可使用Plasmocure™。

如果支原體對(duì)Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均已產(chǎn)生抗性，應(yīng)該怎么辦呢？

如果使用Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均無(wú)法有效清除細(xì)胞中的支原體污染物，則表明樣本中的支原體污染非常嚴(yán)重。這種情況下好的辦法是在下一次傳代時(shí)盡可能稀釋您的細(xì)胞，以此來(lái)稀釋細(xì)胞中的支原體污染物。之后使用不同濃度（確保對(duì)細(xì)胞不會(huì)有太大毒性的濃度）的Plasmocure™再次處理細(xì)胞2周，例如使用工作濃度為50 ug/mL和100 ug/mL的Plasmocure™處理細(xì)胞。處理2周之后，將細(xì)胞分成兩份，一份使用Plasmocure™繼續(xù)處理一周，另一份不添加任何抗生素，3天后使用PlasmoTest™支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)污染情況，以避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。如果您的細(xì)胞仍存在支原體污染，請(qǐng)重復(fù)以上步驟。

以上的操作步驟可有效清除90%的支原體污染，若您樣本中的支原體污染物未得到有效清除，請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系我們。