生物實(shí)驗(yàn)研究中都有哪些常見問題？

發(fā)布時(shí)間： 2024-01-26　　點(diǎn)擊次數(shù)： 363次

常見問題

如何對血清、腹水、培養(yǎng)物上清液等來源的抗體樣品進(jìn)行預(yù)處理？

經(jīng)常用的預(yù)處理方法是沉淀法。對于腹水中的脂蛋白，常用硫酸右旋葡糖酐沉淀，或是在pH=7時(shí)，采用PVP沉淀b-脂蛋白和球蛋白。上樣時(shí)若腹水樣品太粘稠可以使用上樣緩沖液稀釋樣品。對于白蛋白等雜蛋白，可以使用分級沉淀法去除，如硫酸銨沉淀、羊脂酸沉淀等。利用脫鹽柱或透析可以除去鹽離子并更換緩沖液。

純化不與Protein A或G結(jié)合的IgM、IgY該怎么選擇填料？

（1）通常采用沉淀法結(jié)合凝膠過濾法純化IgM，但對于大量純化抗體，這種方案繁瑣且產(chǎn)量低。
（2）采用Protein L親和填料，特異性的結(jié)合κ輕鏈，對純化抗體片段及完整地抗體IgG、IgM和IgA很有用。
（3）嗜硫填料是根據(jù)其配基與抗體間的二硫鍵產(chǎn)生特異性相互作用，中性條件下吸附、洗脫，純化后蛋白活性高，是一種通用型抗體純化手段。

怎么純化抗體Fab 片段？

（1）Protein L可以特異性的結(jié)合抗體的κ輕鏈，因此，只要Fab 片段中含有κ輕鏈，就可以選擇Protein L填料進(jìn)行純化。
（2）Protein G 除了可以特異性結(jié)合IgG 的Fc 片段，還可以特異性低親和的與某些抗體Fab片段結(jié)合。
（3）Protein A只結(jié)合IgG的Fc片段。采用流穿模式，將純的IgG酶解后過Protein A填料，F(xiàn)ab在流穿峰，F(xiàn)c片段結(jié)合在填料上。

如何提高抗體回收率？

（1）更換親和力更高的填料。
（2）對于Protein A填料，結(jié)合pH可以升至8-9。
（3）填料多次使用后殘留物增多，載量降低，建議用6M鹽酸胍或70%乙醇清洗填料。對于耐堿填料可以使用0.1-0.5M NaOH清洗。

為什么洗脫液中沒有正確條帶？

（1）首先看樣品是否結(jié)合，抗體種屬亞型與親和填料是否有親和力，結(jié)合緩沖液pH是否中性，流穿中抗體是否有減少，可將原始樣品和流穿同時(shí)跑SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。
（2）再看樣品是否與填料結(jié)合太牢固，沒有洗脫下來，建議用pH更低的緩沖液洗脫。
（3）洗脫后酸性條件下抗體是否水解，可在收集管中預(yù)先加入中和液或精氨酸等保護(hù)劑，或者選擇能在近中性條件下洗脫的填料。

洗脫后抗體純度不高怎么辦？

（1）洗雜是否全部？可取最后洗雜液跑SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。
（2）適當(dāng)提高結(jié)合時(shí)鹽離子濃度，或在洗雜液中加入低濃度的非離子型去垢劑，降低非特異性吸附。
（3）上樣前樣品預(yù)處理，除去部分雜質(zhì)。
（4）采用兩步純化，先親和層析純化，后經(jīng)離子交換層析，除去HCP 、脫落的 Protein A以及部分聚體等等，得到純度更高的抗體。